丝组二肽对牛血清白蛋白的切割作用研究

高等学校化学学报所究筒报丝组肽对牛血清白蛋白的切割作用研究陈晶万荣刘海蒋宇扬赵玉芬清华大学生命科学与工程研，院，化学系生命有机磷化学教育部重点实验室，北京100084肽与蛋白质的切割作为生物化学中的热点之，具有非常广泛的应用。长期以来，天然存在的多种蛋白酶如胰蛋白酶171糜蛋白酶1付1油子其割的主要工具。但是这些酶只能在某些特定的条件如，值和温度等下使用，而且由于蛋白酶对底物的特异性要求，因而切割蛋白的断裂位点相对较少，有定的局限性而现代生物化学及分子生物学的发展在蛋白切割方面提出了越来越多的要求12，如蛋白部分合成，大蛋白的序列测定，蛋白区域结构与功能的分析，蛋白与其它蛋白核酸膜形成复合物的研究3和蛋白折叠及疾病治疗等等，这些都要求研究新的蛋白切割方法。在这种情况下，化学切割试剂的研宄与发展越来越受到重视。在己有的化学切割试剂中，邪1.由于活性较高，专性地在的碳端切断，副产物较少而得到了较普遍的应用；但是这种试剂毒性较大，反应条件苛刻4.各种过渡金属离子如和，邮1与有机物形成的，物作为1刀，试剂也是研，的热点17，但妃这种试剂的断毅机即。绝大多数是自由基机理，会导致蛋，结构破坏。因此进，研新的化学切割试剂几有很遂要的意义。

众所周知，丝氨酸蛋白酶的活性位点是丝氨酸5，办组氨酸8及天冬氨酸人叩，其中361与此更是不可缺少的1.我们12在以前的工作经发现丝组肽1以水解某呜1和民产生连续的切割谱带。本文中则以丝组肽为模型，模拟天然蛋白酶，研究该肽对蛋白质的切割作用。实验证明，在定的1值范围内，该肽对牛血清白蛋白具有较明显的切割作用。这是种新型1实验部分1.1试剂与材料丝组肽567他1版及组丝肽1购自14物制剂公司美国，丝肽31.，内组肽购自咕以公司，牛血沾白蛋白3，1；奶，8为7分装，丝氨酸办组氨酸汕1购自打尜，乙醇胺乙醇胺乙安及异丙醇胺均为分析纯，丝氨酸甲酯3，6168161由丝氨酸甲酯化得到。实验用水均为去离子水，所有溶液及容器均经过高温高压灭菌。

1.2检测手段切割试剂与83人浓度分别为2.5，1化及181化，在50，与60水浴中保温定时间6，1质试分数12的3此变性聚丙烯酰胺胶分离，快速银染法染色。

2结果与讨论21值与温度对切割的影响使用如，出他1晒8均缓冲液磷酸盐乙酸盐硼酸盐各40丽为缓冲体系，研宄了，植从4.09.他宽范围内的1刃割怙况，发现作5保温反应5后，1出值为60与7.0时，加36样品使原料带明显消失，而相应的空白实验没有明显变化，6.的缺徒，在，1=4，原料发生水解，产生条水解带。在6似1反应50基金项目国家自然科学重点项目基金批准号232004和访问学者基金批准号教技司1999153号资助。

联系人简介赵玉斧1948年出生。，女，博士，教授，博士生导师，中国科学院院士，主要从事生命有机化学研后，你5.认6.0的原料带都彻底消失，而1=7.的原料带还有残余惘1.由此可知，5.也在近中性，条件下1=5.07.0对蛋白质的切割活性*高。

22缓冲液种类对切割的影响8只缓冲液柠檬酸，檬酸钠缓冲体系磷酸氢钠磷酸氢钠缓冲体系心他缓冲体系不加缓冲液对比所有缓冲液均为=6.0，6厂反应24，实验明，8辟爱冲液及磷酸盐缓冲液对切割有明显的促进作用，而柠檬酸盐缓冲液与珏81缓冲液则抑制反应进行；不加缓冲液3，158自身具有定的缓冲能力，在反应前后1值基本保持在6 0左右时可看到加361后83人原料带变弱，但相对8，爰冲液与磷酸盐缓冲液变化不明显2.

23反应基团作用的研究为研宄。1各官能1在切削1心时所可能起到的作用，分别用结构上与3枕心相似的组丝肽他3丝丙肽361入丙组肽58丝氨酸组氨酸丝氨酸甲酯乙醇胺其相似性3乙醇胺及乙醇胺为对照，研究它们对路人的切割作用浓度与以上反应相1无切割活性，而1为7.0时，36人13具有微弱的切割活性4，这说明361残基侧链的羟基是1具有切割活性的必须官能团，而出残基则增强了切割活性。23，与1在反应100后对83人没有明显作用4，说明3，他即使在反应中水解产生361.与其切割活性也不是由这两种物质弓引的。3丝氨酸丝氨酸甲酿乙醇胺乙醇胺及乙醇胺对85人无切割活性5，考虑到5无切割活性5则证明切割试剂分子中各个官能团之间的空间位置对切割作用也有很重要的影响。

割活性的必需基团，而肽的酰铵键与羧基同组氨酸残基上的咪唑环起在定程度上，强了切割活性。反应的*适1值接近中性5.7.0.所有的实验均现出很好的重现性，而且以细胞色索溶菌酶为切割底物得到了类似的结果。在自然界广泛存在的各种丝氨酸蛋白水解酶的活性中心都是丝氨酸组氨酸及天冬氨酸而且前两种氨基酸是缺+可的如果人为地将这两种物质在空间上靠拢之后，仍具有定的活性，由此可以想象若地球上不存在具有高的活性与选择性的功能性高分子时，些化学上具有定特殊性的物质如；8将起重要作用。然后在地球的进化过程中，这些物质通过在结构上不断完善使自身的功能得到显著提高，*终发展成为现在的生命状态。在这里也可以看到，3，版切割83人的活性很低，而且其机理仍不很清楚，从反应基团作用的研究以及己有的对丝氨酸蛋白酶水解机理的了解，可以认为是36通过咪唑环与蛋白的负电性基团如羰基及竣基弱的切割活性，然后丝氨酸残基上的羟基进攻酰胺键，使蛋白质断裂。但这假设是否成立，还需要更多的实验数据予以证明。